1. 檢測(cè)原理

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被小鼠免疫球蛋白G（IgG）（固相抗原）的微孔酶標(biāo)板中，加入小鼠免疫球蛋白G（IgG）標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體（HRP標(biāo)記抗體），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，加入顯色底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，終轉(zhuǎn)化為黃色。在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中小鼠免疫球蛋白G（IgG）的濃度呈反比。擬合標(biāo)準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中小鼠免疫球蛋白G （IgG）的濃度。

2. 試劑盒檢測(cè)的局限

1）只供科研使用，不得用于臨床診斷

2）請(qǐng)?jiān)诒驹噭┖袠?biāo)示的效期內(nèi)使用。

3）試劑盒的試劑不能與其他批號(hào)的試劑或其他來(lái)源的試劑混合使用。

4）任何操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、孵育溫度、試劑盒保存時(shí)間的改變，都將影響結(jié)合反

應(yīng)。

二、基本信息

1. 試劑盒提供的材料

2. 未提供的材料設(shè)備

1）能夠檢測(cè) 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀

2）移液器及槍頭、加樣槽

3）37℃恒溫箱或水浴鍋

4）準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等

5）蒸餾水或去離子水

6）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

3.貯存

試劑盒保存于 2 - 8℃，效期標(biāo)注于標(biāo)簽上（效期一般是6個(gè)月）。如果試劑盒的組分需要再次使用， 請(qǐng)確保上一次使用之后沒(méi)有被污染。

4.注意事項(xiàng)

1）所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害。

2）只有經(jīng)過(guò)良好實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時(shí)請(qǐng)佩戴合適的防護(hù)設(shè)

施，例如白大衣、乳膠手套、安全眼鏡等。

3）請(qǐng)避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請(qǐng)立即用大量清水清洗。

4）試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時(shí)，請(qǐng)佩戴防護(hù)服，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)施。

5）本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6）請(qǐng)不要使用過(guò)期的試劑。

7)在試劑盒的貯存或孵育過(guò)程請(qǐng)避免強(qiáng)光照射。

8)在操作試劑盒或處理樣本時(shí)請(qǐng)佩戴乳膠或一次性手套。

9)為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請(qǐng)使用一次性槍頭。

10)使用干凈的容器配制試劑。

11)試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水。

12)顯色底物在使用之必須平衡至室溫。

13)液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入 1.0 %的次氯酸鈉，浸泡 30 分鐘。含酸的

液體廢棄物，請(qǐng)先中和， 再加入次氯酸鈉。

三、檢測(cè)準(zhǔn)備與步驟

1.樣本采集與貯存

細(xì)胞培養(yǎng)上清

2000 × g條件下離心20m分鐘，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反

復(fù)凍融。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，2000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻

檢測(cè)，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。

血漿樣本

EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。2000 × g 離心 20 分鐘收集樣本。即刻檢測(cè)，

或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。

組織樣本

用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在

冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻 漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。后將勻

漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測(cè)。

細(xì)胞提取液樣本

貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮

細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL

PBS重懸并通過(guò)反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。

注意：1）避免樣本的反復(fù)凍融，在檢測(cè)，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔混勻。

2）本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本，但是未充分驗(yàn)證。

2.試劑準(zhǔn)備

1）用，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2）濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)

晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3）標(biāo)準(zhǔn)品配置：取7個(gè)1.5ml離心管，分別標(biāo)為S1-S7，先將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍至10000ng/ml放入離心管S7中，再依次倍比稀釋為5000ng/ml、2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.25ng/ml，并分別依次裝入S6-S1中。

4）HRP-抗體工作液配置：使用20min用HRP-抗體稀釋液將100×HRP-抗體稀釋到1×工作液，根據(jù)所需量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。

5）TMB顯色液配置：使用10min，將TMB顯色液A液和B液1:1混合，避光放置備用。

6）待測(cè)樣品稀釋?zhuān)侯A(yù)估樣品濃度，將待測(cè)樣品稀釋至標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)。

3.檢測(cè)步驟

1）試劑、樣本平衡：檢測(cè)之請(qǐng)將所有的試劑、樣本平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，建議做復(fù)孔。

2）加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，

樣本孔加待測(cè)樣本50μl，空白孔加50μl稀釋液。

3）加 HRP標(biāo)記抗體：在所有孔中加入稀釋后的1×HRP-抗體工作液 100μl。

4）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。

5）洗滌：棄掉液體，每孔加入350μl洗液洗板，靜置1-2min，洗滌3-5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能，必須徹底移除殘留液體。

6）加底物顯色：每孔加入100μl配置好的TMB顯色液，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘。

7）加終止液：每孔加入50μl終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，充分混勻。

8）檢測(cè)讀數(shù)：在 15分鐘之內(nèi)，使用450nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)。

四、分析

1.結(jié)果計(jì)算

1）復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才可以，復(fù)孔平均值可作為測(cè)量值。

2）每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒(méi)有做校正孔，則不需要減

去)。

3）檢測(cè)完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟

件，采用四參數(shù)曲線擬合，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值，濃度值與顯色程度呈反比。

4）如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測(cè)的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的終濃度。

2.試劑盒的性能

1）物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣。

2）檢測(cè)范圍156.25ng/ml –10000ng/ml

3)靈敏度

低可檢測(cè)濃度為50ng/ml 。

4)特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組小鼠免疫球蛋白G（IgG）。

5)穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，效期6個(gè)月。

說(shuō)明